PCR

La técnica de PCR, cuyas siglas en inglés significan “Reacción en cadena de la polimerasa” es una técnica de biología molecular que permite detectar un fragmento de ADN de un patógeno (virus, bacterias, hongos u otro) o mutaciones genéticas que deseamos saber si se encuentran en una muestra clínica (sangre, esputo, biopsia, suero, etc.). Dentro del ADN de un patógeno existen regiones únicas que lo diferencian de otros patógenos, a esta región se le denomina marcador molecular.

Antes de realizar una PCR, se debe extraer el ADN mediante el uso de reactivos que permitan liberarlo de una muestra clínica. Debido a que el ADN es difícil de observar o detectar por métodos serológicos, inmunológicos o microscópicos, se emplea la técnica de PCR. Esta técnica se basa en la multiplicación exponencial de una región de interés del ADN mediante el uso de elementos (enzima, cebadores, nucleótidos) que son específicos para cada patógeno o mutación, y empleando un equipo llamado termociclador. Este equipo va realizar cambios de temperatura sobre el ADN permitiendo que se duplique a un número tan grande que pueda ser detectado por un software donde el resultado es obtenido de manera objetiva. La forma de detección depende del tipo de PCR.

Existen dos tipos de PCR: PCR convencional y PCR en tiempo real. Ambas tienen el mismo principio de multiplicar la región de interés, pero se diferencian en que la PCR en tiempo real es más específica debido al uso de otros elementos denominados sondas y tiene la ventaja de que la detección se va realizando mientras aumenta el número de copias de la región de interés, es decir que la detección se hace en tiempo real permitiendo de esta forma, además de detectar, cuantificar la cantidad de ADN del patógeno que pueda encontrarse en la muestra clínica.

Entre otros tipos de PCR tenemos: 

• PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos, ya que se realiza en 2 PCR consecutivas.
• PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios fragmentos de ADN a la vez, en una sola reacción y con una sola muestra. Esto nos permite detectar varios patógenos en una sola muestra.
• PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): en este caso se extrae ARN a partir de la muestra. Luego, este ARN se convertirá en ADN por un proceso llamado transcripción reversa. En este proceso se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utilizan algunos virus como el VIH, el hepatitis C, entre otros. Además, de detectar virus, este tipo de PCR también nos permite determinar el nivel de expresión de un gen en particular.

La PCR es una técnica muy útil en distintas áreas de la salud y ciencias básicas. Entre los tipos de diagnósticos que se realizan con la técnica de PCR tenemos:

Detección de mutaciones genéticas: las enfermedades genéticas están causadas por una mutación en una región específica del ADN, estudiarlas directamente es muy difícil, por eso se opta por multiplicar primero la región del ADN que se quiere identificar a partir de la muestra y emplear la técnica de PCR. Después de realizar la PCR, la región de interés tendrá más de un millón de copias permitiendo así su detección. De esta forma se confirma el diagnóstico de muchas enfermedades genéticas, así como la predisposición o riesgo de tener alguna enfermedad como el Alzheimer, cáncer de tiroides, leucemias, fibrosis quística, o presentar trombosis, entre otros.

 Diagnóstico microbiológico: El método clásico para identificar una bacteria u otro microorganismo es aislarlo en un cultivo microbiológico, pero a veces no es posible llevarlo a cabo, ya sea porque el método de cultivo es difícil, la sensibilidad es muy baja o demora muchos días en dar un resultado. En esos casos la PCR puede detectar material genético del microorganismo con alta sensibilidad y en pocos días.

Con este tipo de diagnóstico se puede detectar microorganismos como Mycobacterium tuberculosiscausante de la tuberculosis, Helicobacter pylori causante del cáncer gástrico, otras como Chlamydia, Neisseria y Trichomonas involucradas en las infecciones de transmisión sexual; entre otros microorganismos.

Detección de virus: Existen distintos tipos de virus que pueden infectar al humano. Para la detección de estos virus se debe amplificar una región conservada de ADN o ARN (en caso sea un virus cuyo material genético es solo ARN, para este se deberá realizar una transcripción para convertir el ARN en ADN para luego amplificar la región deseada).

La detección de los virus sirve para evaluar la presencia y los niveles virales periódicamente, esto con el fin de conocer la gravedad de la enfermedad o el progreso de un tratamiento antiviral. Entre los virus que detectamos se encuentran, el papiloma virus humano, el virus de la hepatitis B y C, virus respiratorios, virus del Zika, Chikungunya y Dengue, citomegalovirus, VIH, entre otros.

Cuando llegues a la consulta el médico te hará unas preguntas generales sobre tu estado de salud: enfermedades importantes, factores de riesgo, estilo de vida, síntomas de infección, etc. El análisis de la PCR lo solicitará el médico cuando lo considere necesario para diagnosticar su enfermedad ya sea infecciosa o genética.

Se realizará la toma de muestra para el análisis de PCR de acuerdo al tipo de afección presentada, por ejemplo: si es un esputo mejor que sea a primera hora de la mañana. Esos detalles te los hará saber el médico antes de realizarte la prueba y también tomando en consideración lo indicado en el link toma de muestra.

Debido a que el estudio de la PCR se realiza en el laboratorio y con el fin de que conozcan más sobre esta técnica, a continuación le resumimos cómo se realiza una PCR:

1. Primero, se extrae el ADN a partir de la muestra recogida (orina, hisopado cervical, biopsias, aspirado bronquial, sangre, etc.). Esto incluye células de tu propio cuerpo, pero también material de cualquier patógeno presente.
2. Luego, el ADN extraído se mezclará con algunos componentes necesarios para realizar la PCR.
3. Se calienta el ADN hasta casi los 96°C para que las dos cadenas de ADN se separen.
4. Se añade a la muestra un cebador; esto es una secuencia sintética de ADN producida en laboratorio, que se une a un ADN ya conocido que se quiere detectar en la muestra. Por ejemplo, si queremos detectar citomegalovirus utilizaremos un cebador específico para él.
5. Posteriormente, se baja la temperatura entre 50-60°C para que el cebador se una al ADN de la muestra del paciente. Acto seguido empieza a funcionar una enzima llamada DNA polimerasa a 72 °C, que duplica el ADN que se está estudiando.
6. Se repiten los pasos previos desde la separación de las hebras, y cada vez que termine un ciclo se obtendrá una duplicación de las cadenas de ADN estudiado.
7. Con el ADN amplificado ya se pueden realizar la detección, cuantificación y estudios genéticos de forma fácil y rápida.

Complicaciones de la PCR

No existen complicaciones conocidas con la técnica de PCR. Es una prueba confiable para el diagnóstico de diversas enfermedades infecciosas o genéticas. La toma de la muestra no suele presentar daños al paciente, excepto las biopsias según el órgano del que se tomen.

Los resultados de la PCR  son rápidos y dependiendo del servicio puede demorar de 3 a 6 horas desde que se empieza a procesar hasta que se obtienen los resultados. Esto es debido a que usamos la metodología del PCR en tiempo real. Para recoger el resultado hay que acudir en los días que son indicados por nuestro personal que recepcionará la muestra. El tiempo máximo de espera es de 10 días útiles. Con el resultado Ud. podrá ir a consulta con su médico para que le realice la interpretación más adecuada del resultado. Aunque, también estamos presto a esclarecer cualquier duda del resultado.

El resultado de la PCR de tipo cualitativo se da como positivo o negativo. Es decir, se ha encontrado el ADN que esperábamos, o no. Eso es esencial para poder identificar el patógeno y proporcionar un tratamiento específico, o poder diagnosticar una enfermedad genética.

La PCR de tipo cuantitativo se expresa en valores numéricos acompañados con sus unidades como por ejemplo: copias genómicas por mililitro (mL) o Unidades Internacionales (UI) por mililitro (mL).

La PCR en Tiempo Real en muestras como esputo, aspirado bronquial u otras relacionadas al tracto respiratorio tienen sensibilidad y especificidad cercanas al 100%, por ejemplo en las detecciones de tuberculosis, virus respiratorio y bacterias respiratorio. Pero en muestras donde no se haya con frecuencia el patógeno y en muestras paucibacilares (bajo nivel de bacilos, por ejemplo: el líquido cefalorraquídeo) estos valores bajan hasta un 60% por lo que la sensibilidad en la detección disminuye y pueden darse los resultados falsos negativos